۳-۱-۳-۱: مواد و دستگاه های مورد نیاز
همزن برقی، ترازوی دیجیتال، دستگاه اتوکلاو، پلیت استریل. مگنت همزن، هود لامینار، دستگاه pH متر، ارلن استریل
محیط کشت BHI Broth، Haemophilus Growth Supplement
۳-۱-۳-۲: روش تهیه ۵۰۰ میلی لیتر محیط کشت BHI+ supplemenمایع
مقدار ۵/۱۶ گرم از محیط کشت BHI broth توسط ترازوی دیجیتال وزن شده و به همراه ۴۰۰ میلی لیتر آب مقطر درون ارلن توسط همزن برقی مخلوط شد
pH محیط توسط دستگاه pH متر بین ۶/۷ و ۸ تنظیم شد و سپس حجم به ۵۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
سپس محیط به مدت ۲۰ دقیقه تحت فشار ۵/۱ بار و دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد اتوکلاو شد.
پس از سرد شدن یک شیشه پودر Haemophilus Growth supplement حاوی ۵/۷ میلی گرم Haemin و ۵/۷ میلی گرم NAD ساخت شرکت HIMEDIA هند با ۵ میلی لیتر آب مقطر استریل مخلوط شده و در شرایط استریل به محیط اضافه شده و به خوبی مخلوط شد.
۳-۲: کشت نمونه ها
نمونه های تهیه شده از بیمارانی که به بیمارستان مراجعه کرده بودند، شامل نمونه های خون، سوآپ از حلق و مایع مغزی نخاعی بود. این نمونه ها که روی محیط شکلات آگار کشت داده شده بود و از نظر تست های میکروبیولوژی هموفیلوس آنفلونزا تشخیص داده شده بود، زیر هود لامینار به صورت استریپ روی محیط کشت شکلات آگار که از پیش تهیه شده بود کشت داده شد. برای این منظور ۱ کلنی توسط لوپ استریل برداشته شده و به محیط شکلات آگار جامد به صورت استریپ انتقال داده شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

پلیت ها در درون انکوباتور به مدت ۲۴ ساعت به همراه ۵% دی اکسید کربن انکوبه شدند.
پس از رشد از باکتری ها برای رنگ آمیزی گرم ،استخراج DNA ، فریز کردن و استخراج PRP استفاده شد که در ادامه توضیح داده خواهد شد.
۳-۳: فریز کردن باکتری
۳-۳-۱: مواد و تجهیزات لازم
هود لامینار، دستکاه ورتکس،دستگاه اسپکتروفتومتر، کرایو تیوب، یخچال ۷۰- درجه، پیپت استریل
محیط کشت BHI، گلیسرول استریل،
۳-۳-۲: روش فریز کردن
نمونه به ۵۰ میلی لیتر محیط مایع BHI+supplement وارد شده و درون انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد همراه با شیکینگ و Co2 ۵% قرار داده شد.
پس از ورود باکتری به مرحله رشد ،برای مشخص شدن مرحله رشد لگاریتمی باکتری[۴۶] ،جذب نوری محیط در طول موج ۶۰۰ نانومتر توسط دستگاه اسپکترو فتومتر با فاصله ۱ ساعت اندازه گیری شد.
با رسیدن جذب نوری به ۴/۰ محیط برای فریز کردن از انکوباتور خارج شد.
گلیسرول استریل به میزان ۲۰ درصد به محیط اضافه و به خوبی مخلوط شد.
استوک به دست آمده در کرایوتیوب های ۱ میلی لیتری ریخته شده و نام و شماره نمونه همراه تاریخ روی آن یادداشت شد.
تیوب ها یک روز در یخچال ۲۰- درجه نگه داری شده و سپس به یخچال ۷۰- درجه منتقل شدند.
۳-۴: شناسایی عمومی هموفیلوس آنفلونزا
۳-۴-۱: تست نیاز های غذایی
همان طور که در فصل یک اشاره شد گونه هموفیلوس آنفلونزا برای رشد در محیط کشت نیاز به دو فاکتور غذایی هِمین (X) و NAD (V) دارد و این شاخصه به عنوان روشی برای تشخیص این گونه مورد استفاده قرار میگیرد.
به این منظور تعدادی پلیت حاوی محیط کشت BHI آگار تهیه شد. در شرایط استریل نمونه با بهره گرفتن از یک سواپ روی محیط BHI پاساژ داده شد. دیسک های آماده X, V, VX محصول شرکت HIMEDIA هند با فاصله روی محیط قرار داده شد.
در نهایت پلیت ها در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد و ۵% دی اکسید کربن به مدت ۲۴ ساعت انکوبه شد.
رشد باکتری ها در اطراف دیسک XV و عدم رشد در اطراف دیسک X و V به تنهایی نشان دهنده گونه هموفیلوس آنفلونزا می باشد.
۳-۴-۲: رنگ آمیزی گرم
۳-۴-۲-۱: مواد و تجهیزات لازم
شعله، لام، هود لامینار، سمپلر ۱۰۰-۱۰۰۰، پیست آب مقطر، ظرف مخصوص رنگ آمیزی، آنس استریل. قطره چکان
رنگ کریستال ویوله،محلول الکل استن، محلول لوگل، رنگ سافرانین (فوشین)، آب مقطر
۳-۴-۲-۲: روش رنگ آمیزی گرم
تهیه گسترش روی لام : یک قطره آب مقطر روی لام چکانده سپس با لوپ استریل یک کلنی تازه از محیط برداشته و داخل قطره آب حل شد و پس از خشک شدن لام جهت فیکس کردن نمونه سه بار از روی شعله عبور داده شد.
رنگ آمیزی با کریستال ویوله : در این مرحله مقداری از رنگ کریستال ویوله با قطره چکان به روی سطح گسترش میکروبی روی لام به مدت یک دقیقه قرار داده شد تا رنگ در دیواره سلولی میکروبها نفوذ کند.
مرحله شستشو: رنگ اضافی روی لام خالی شده و با بهره گرفتن از آب مقطر سطح روی گسترش شست و شو داده شد.
مرحله اضافه کردن محلول لوگل : چند قطره از محلول لوگل را روی گسترش پخش کرده و اجازه دادیم ۳۰ ثانیه روی نمونه باقی بماند . سپس محلول اضافی خالی شده و لام با آب مقطر شست و شو داده شد.
مرحله رنگ بری با بهره گرفتن از استن الکل : لام را با زاویه ۴۵ درجه نگه داشته و با بهره گرفتن از محلول رنگ بر الکل استن بسرعت شست و شو داده شد.
رنگ آمیزی با سافرانین: در این مرحله سطح گسترش را با رنگ ثانویه یعنی سافرانین به مدت ۳۰ الی ۶۰ ثانیه پوشانده شد و سپس با آب مقطر شسته شد.
لام رنگ آمیزی شده روی کاغذ خشک کن قرار داده شد تا خشک شود.
نمونه رنگ آمیزی شده زیر میکروسکوپ نوری با لنز ۱۰۰ (بزرگنمایی ۱۰۰۰ برابر) مشاهده شد.
۳-۵: واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)
۳-۵-۱: استخراج DNA از باکتری به روش جوشاندن
۳-۵-۱-۱: مواد و تجهیزات لازم

موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...