• جهت قرائت نتیجه، در هر میدان میکروسکوپی تعداد کل نوتروفیل­ها، نوتروفیل­هایی که فاگوسیتوز ننموده­اند (سلول­های آبی کم­رنگ) و نوتروفیل­های حاوی مخمر(سلول­های آبی پررنگ) شمارش شده، تا درصد بیگانه­خواری نوتروفیل مشخص شود.
    • لازم به ذکر است که رنگ آمیزی گیمسا هم برای نمونه­ها انجام شده و تفاوتی در نتایج این روش با روش هماتوکسلین- ائوزین مشاهده نشد.

      • ( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۱۰- سنجش انفجار تنفسی توسط احیاء نیتروبلوتترازولیوم (NBT)[56] (Brousseau et al.,1990)
اساس آزمایش
این تست برای تعیین توانایی فاگوسیت­هایی چون نوتروفیل­ها جهت تولید واسطه­های فعال اکسیژن (به عنوان یکی از مراحل مهم در محدود سازی عامل پاتوژن) به کار می­رود. NBT ترکیب شفاف و زرد رنگ محلولی است که در مجاورت به فرم احیا شده فرمازان (رنگ آبی) تبدیل می­ شود.
مواد و وسایل مورد نیاز

  • هود لامینار (Beasat, Iran)
  • انکوباتور Co2 دار (New brunswick scientific, USA)
  • سانتریفیوژ یخچال دار (Eppendorf, Germany)
  • دستگاه الایزا ریدر (شرکت نوین گستر، مدل DANA3200).
  • محیط کشت RPMI 1640 (Gibco, UK)
  • ترازوی دیجیتالی (Nikon, Japan)
  • سوسپانسیون مخمر اپسونیزه
  • سوسپانسیون سلولی نوتروفیل
  • پودر NBT (شرکت Sigma)
  • پودر زیموزان ساکارومایسس سرویزیه (شرکت Sigma)
  • مادهNN – دی متیل فورماید (شرکت Sigma)
  • میکروپلیت ۹۶ خانه درب دار و ته صاف، استریل (Nunc, Germany)
  • میکروتیوپ ۲میلی لیتری
  • سمپلر ۱۰۰ و ۱۰۰۰ میکرولیتری
  • پیپتگیر اتوماتیک (شرکت Eppondrof آلمان)، پیپت در اندازه ۵ میلی لیتری و پیپت پاستور استریل

روش کار

  • قبل از انجام تست، محلول NBT در محیط کشت RPMI به میزانmg/ml 1 از پودر NBT و mg/ml 5 از زیموزان حل نموده و به خوبی همگن شد.
  • از طرف دیگر، سوسپانسیون سلولی نوتروفیل (گروه تیمار و کنترل) با تراکم/ml 106×۴ در میکروتیوپ­های جداگانه با سوسپانسیون مخمر اپسونیزه شده به مدت ۱ساعت در C˚۳۷ انکوبه شد.
  • µl 15 از محلول آماده NBT باµl 15 سوسپانسیون سلولی که مرحله فاگوسیتوز را انجام داده، مخلوط گردید.
  • میکروتیوپ را به مدت یک ساعت در C˚۳۷ انکوباسیون شد.
  • به محتوی میکروتیوپ،µl 400 از ماده NN – دی متیل فورماید اضافه شد.
  • میکروتیوپ با سرعتg 3000 و در دمای C˚۴ سانتریفیوژ گردید.
  • دانسیته نوری (OD) µl200 از مایع رویی میکروتیوپ با دستگاه الایزا ریدر و طول موجnm 492 تعیین شد.

۳-۱۱- سنجش زنده­مانی سلول نوتروفیل در مواجه با MSCs و مایع رویی آن (Delirezh et al., 2009,Turina.,2005)
مواد و وسایل لازم

  • لوله فالکن ml15
  • پیپتml 10
  • پیپت گیر اتوماتیک
  • سمپلر۱۰،۱۰۰و۱۰۰۰
  • لام سنگی
  • لام نئوبار
  • سانتریفیوژ یخچال دار
  • رنگ Achridin Orange/P I

روش آزمایش
سنجش میزان زنده­مانی نوتروفیل­ها بعد از مجاورسازی با سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان تیمار شده با غلظت­های مختلف ویتامین D3 با بهره گرفتن از میکروسکوپ فلورسانس انجام گرفت به این ترتیب که :

  • پس از اتمام زمان مجاور سازی مایع رویی داخل فلاسک که حاوی سلول­های نوتروفیل مجاور شده با سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان تیمار شده با غلظت­های مختلف ویتامین D3 می­باشند به داخل لوله فالکن ml15 استریل جمع آوری شده و به مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۱۴۰۰ دور سانتریفیوژ گردید.
موضوعات: بدون موضوع  لینک ثابت


فرم در حال بارگذاری ...